尊龙凯时在生物医疗领域的贡献不可忽视,尤其是在标记定量蛋白质组学方面。这种技术通过化学或同位素标签对蛋白质或肽段进行标记,以便在质谱分析中区分不同样本,从而实现相对或绝对定量。常用的方法包括iTRAQ、TMT和SILAC。
SILAC是一种代谢标记方法,通常用于细胞培养,支持2-3重,最高可达4重以上的重标记,定量在一级质谱(MS1)水平进行。相比之下,iTRAQ和TMT是化学同位素标记技术,分别支持4-8重和10-18重,定量则在二级质谱(MS2)层面进行,适合高通量的研究。
与非标记方法相比,基于标记的定量蛋白质组学具有更高的定量准确性和样本间良好的重现性。这是因为所有样品可以同时混合和分析,减少了单独运行带来的技术差异。选择合适的标记定量方法时,需要考虑样本类型、实验规模和研究目标。例如,使用活细胞时可以选择SILAC,而iTRAQ和TMT适用于组织或体液样本的中等和高通量研究。
在iTRAQ/TMT实验中,采用MS²进行报告离子定量的原因在于,所有标记肽段在MS¹上具有相同的质量数,无法区分,而在MS²碎裂后能释放出不同m/z的报告离子,从而实现更精准的定量。此外,基于标记的定量蛋白质组学也可以用于绝对定量,通过使用已知浓度的标准肽段或蛋白质进行校准。
在进行TMT或iTRAQ实验时,应选择来源一致、处理条件明确且具有可比性的样本。这样可以避免不同组织间蛋白组成的显著差异对数据的影响。部分信号偏移可以通过数据归一化处理解决,但若生物本底差异过大,归一化可能会掩盖真实差异。
对于使用SILAC标记后的细胞,建议在连续传代至少5-6代后提取细胞蛋白,以确保标记充分。标记效率可通过质谱预实验检测,标记率需≥95%才能进行正式分析。在TMT实验中,可以通过SDS-PAGE定量比对样本的均匀性,若发现偏差需要重新标记或混合。
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