引言靶向蛋白质降解是一种新兴的生物医疗策略，旨在为治疗目的从细胞中选择性地清除特定蛋白质。尽管最初的研究主要集中在PROTAC分子上，近年来，新的靶向降解方法层出不穷，其中之一便是降解TAG（dTAG）技术。dTAG是一种创新的靶标验证技术，类似于PROTACs，该方法利用一种异双功能小分子，形成目标蛋白与E3泛素连接酶之间的三元复合物。不同之处在于，dTAG技术结合了CRISPR/Cas9技术，将双功能降解剂的一部分结合位点引入目标蛋白中，使其成为靶标验证研究和剂量依赖效应探索的理想工具。

在本文中，dTAG的蛋白降解分析采用双荧光素酶报告系统来评估靶蛋白的降解情况。我们使用萤火虫荧光素酶作为基准标记物，确保其不受dTAG降解影响。纳米荧光素酶（Nanoluciferase）则以碎片化的非活性形式（HiBiT）与靶蛋白融合。dTAG降解剂通过引入的dTAG结合位序，将靶蛋白与E3泛素连接酶连接，从而形成三元复合物，最终导致靶蛋白及其融合的HiBiT片段被泛素化并降解。为了测量纳米荧光素酶的荧光发射，降解后加入LgBiT，这一小型纳米荧光素酶片段能够完成未降解的HiBiT，从而形成活性纳米荧光素酶，产生荧光信号。纳米荧光素酶与萤火虫荧光素酶的发射比值则指示了dTAG降解剂的效能，比例越低，目标的降解程度越高。

研究目标本研究的目标是通过对dTAG结构进行改进，优化已知dTAG支架的动力学特性。研究人员将dTAG降解剂或DMSO对照物分配到1536孔iSTAR微孔板中。随后，将稳定转染了pSBTK-HiBiT-dTAG-TargetX-P2A-Fluc-T2A-Puro质粒的HEK293细胞单层从培养瓶中分离，制备成细胞悬液。在1400rpm离心4分钟后，去除上清液，将细胞沉淀重悬于含2%胎牛血清的OPTIMEM培养基中。每孔添加25µL细胞悬液，微孔板短暂离心后置于5%CO2、37℃的环境中孵育4小时。随后，每孔加入25µLOneGlo试剂，经过10分钟的孵育和300rpm震荡，使用PHERAstarFSX读取萤火虫荧光素酶的发射。接着再加入25µLStopGlo试剂、0.025µL纳米荧光素酶底物和1/100的LgBiT，酶标仪于1分钟离心后，再次使用PHERAstarFSX读取纳米荧光素酶的化学发光。

在dTAG降解剂的评估测试中，选取多种dTAG降解剂以不同浓度（0.1至10,000nM）诱导HiBiT靶向降解，使用1536孔酶标仪进行测量。结果显示，所有测试的dTAG降解剂均以浓度依赖的方式导致纳米荧光素酶发射量下降（即HiBiT的降解）。然而，不同的dTAG分子在HiBiT降解的效果上存在差异，例如，dTAG-13 引起约50%的降解，而dTAG-v1则表现出最强的降解效果，几乎完全降解HiBiT。

在后续实验中，进一步评估dTAG-v1降解剂的数据稳定性，浓度范围在1到10µM，并进行32次重复实验，与DMSO对照组进行比较。计算dTAG-v1 HiBiT信号的信号与空白比值（S/B值）以及Z′因子以评估数据的稳定性。结果显示，与DMSO对照相比，所有浓度的dTAG-v1均导致HiBiT融合蛋白降解，表明数据稳定性良好，其Z因子在0.84至0.87之间。

结论通过使用dTAG蛋白质降解检测，所测试的dTAG分子能够成功诱导HiBiT融合蛋白质复合物的靶向降解。由于其高灵敏度、快速读取时间及缩小规模的兼容性，PHERAstarFSX仪器非常适合该类生物医疗应用，可以与iSTAR板配合使用，其性能优于类似的酶标仪。借助尊龙凯时的设备，我们相信可以进一步推动这一领域的研究进展。